Molecular evaluation of piroplasms and hematological changes in canine blood stored in a clinical laboratory in Niterói, Rio de Janeiro / Avaliação molecular de piroplasmídeos e alterações hematológicas em amostras de sangue de cães armazenadas em laboratório de análises clínicas de Niterói, Rio de Janeiro

Abstract Piroplasm species were analyzed by molecular tools in total 31 blood samples from positive dogs, previously checked by stained slides, stored until DNA extraction between 2016 to 2018 in the laboratory Clinical Analyzes in Niterói, Rio de Janeiro. The piroplasms were identified by PCR, targeting the 18S rRNA gene and sequencing. From the total number of samples only 24 (77.4%) were positive and show adequate nucleotide sequences for interpretation with identity between 93%-100% with Babesia vogeli in compared to the sequences isolated of infected dogs from other states in Brazil deposited on GenBank. Most of dogs infected with B. vogeli had anemia (62.5%) and thrombocytopenia (95.8%). The findings of this study are compatible with previous reports in the literature and highlight B. vogeli as the most incriminated species in canine piroplasmosis in Brazil, and thrombocytopenia the hematological alteration most frequently identified in this infection. It is important to note that this is the first study involving the molecular characterization of piroplasms in the metropolitan region of Rio de Janeiro, based on PCR followed by sequencing.

Resumo Espécies de piroplasmídeos foram analisadas por meio de métodos moleculares, em 31 amostras de sangue de cães, previamente verificadas em lâminas coradas, estocadas até a extração de DNA entre 2016 a 2018 em laboratório de Análises Clínicas, em Niterói, Rio de Janeiro. Os piroplasmídeos foram identificados pela PCR, utilizando-se como alvo o gene 18S RNAr e, posteriormente, o sequenciamento. Do total de amostras analisadas, somente 24 (77,4%) foram positivas e apresentaram sequências nucleotídicas adequadas para interpretação com identidade variando entre 93% a 100% com B. vogeli, em comparação com as sequências isoladas de cães infectados de outros estados do Brasil, depositadas no GenBank. A maioria das amostras de sangue dos cães detectados com B. vogeli apresentaram, no hemograma, anemia (62,5%) e trombocitopenia (95,8%). Os resultados detectados neste estudo estão compatíveis com o evidenciado na literatura, pois B. vogeli tem sido a espécie mais relatada nas infecções caninas no Brasil, sendo a trombocitopenia a alteração hematológica mais evidenciada nas amostras analisadas. É importante ressaltar que este é o primeiro estudo envolvendo análise molecular e caracterização de piroplasmídeos, em amostras de sangue de cães da região metropolitana do Rio de Janeiro, utilizando-se a PCR associada ao sequenciamento.

Clinical and hematological evaluation of Rangelia vitalii-naturally infected dogs in southeastern Brazil / Avaliação clínica e hematológica de cães naturalmente infectados por Rangelia vitalii no sudeste do Brasil

Abstract Rangelia vitalii, a tick-borne piroplasm that infects dogs, has been recently molecularly characterized in Brazil, Uruguay and Argentina. Studies on molecular characterization of these piroplasms in different Brazilian regions are scarce. The aim of this study was to evaluate clinical and hematological changes in dogs caused by R. vitalii in the mountainous region of the state of Rio de Janeiro. Blood samples from 36 dogs were evaluated for piroplasms and hematological disorders using light microscopy and molecular analysis. Blood samples from all the animals included in this study were confirmed to be positive for R. vitalii through genetic sequencing. Clinical signspresented by 24 of the 36 dogs of the study were evaluated during appointments or hospitalization within private practice. The most frequent clinical disorders in these dogs that were naturally infected with R. vitalii were fever, spontaneous cutaneous bleeding and diarrhea. Normochromic non-regenerative anemia and thrombocytopenia were the most common hematological disorders in these R. vitalii-positive dogs and therefore should be considered in hematological evaluations on suspected cases.

Resumo Rangelia vitalii, um piroplasma transmitido por carrapatos que infecta cães, foi sendo recentemente caracterizado molecularmente no Brasil, Uruguai e Argentina. Nas diferentes regiões brasileiras são escassos os estudos acerca da caracterização molecular destes piroplasmídeos. O objetivo deste estudo foi avaliar as alterações clínicas e hematológicas em cães causadas por R. vitalii na região serrana do Rio de Janeiro. Amostras de sangue total de 36 cães foram examinadas quanto à presença de piroplasmas pela microscopia de luz, alterações hematológicas e análise molecular. Todos os cães do presente estudo foram positivos para R. vitalii através do sequenciamento genético. Dos 36 animais positivos para R. vitalii, 24 foram avaliados clinicamente. As alterações mais frequentemente observadas foram febre, sangramento cutâneo espontâneo e diarréia. Anemia normocítica normocrômica arregenerativa e trombocitopenia foram as alterações hematológicas mais observadas em cães positivos para R. vitalii, devendo ser consideradas na avaliação hematológica de cães suspeitos.

Tristeza Parasitária em bovinos do semiárido pernambucano / Cattle Tick Fever in semi-arid of Pernambuco

This study aimed to determine the seroprevalence of Babesiosis and Anaplasmosis in cattle from the municipalities of Ouricuri and Petrolina, state of Pernambuco, Brazil, and to define the risk factors for the occurrence of the diseases. Blood samples were collected for serologic testing by Indirect Immunofluorescence Assay (IFA). Sanitary epidemiological questionnaires were applied to the producers aiming to identify possible risk factors. Ticks were collected, identified and tested by Polymerase Chain Reaction (PCR) for the diagnosis of infection by Anaplasma marginale, Babesia bigemina and Babesia bovis. The study was conducted with 861 cattle, being 468 in Petrolina and 393 in Ouricuri. The seroprevalence of A. marginale, B. bigemina and B. bovis in Petrolina was of 35.0% (164/468), 35.9% (168/468) and 32.3% (151/468), respectively; and in Ouricuri was 45.5% (179/393), 38.6% (152/393), and 54.9% (216/393), respectively. Co-infection for Anaplasma spp. and Babesia spp. was observed in 31.6% and 32.1% samples of Petrolina and Ouricuri, respectively. The detection of DNA of Babesia spp. by PCR was possible in 5.8% (8/137) ticks; which 62.5% (5/8) was detected later infection with B. bovis; and 23.3% (32/137) with A. marginale. The presence of ticks, the use of acaricide, age, race, and county of residence of the animals were identified as risk factors for TBD by univariate analysis and multivariate. This study allowed the characterization of the municipalities studied as enzootic instability areas for these hemoparasitic, and consequently alert for adoption of adequate control measures and new studies.

Este estudo objetivou determinar a soroprevalência da Babesiose e Anaplasmose em bovinos dos municípios de Ouricuri e Petrolina, estado de Pernambuco, Brasil; e definir os possíveis fatores de risco para a ocorrência dessas doenças. Amostras de sangue foram coletadas para realização de teste sorológico por Imunofluorescência Indireta (RIFI). Questionários epidemiológicos sanitários foram aplicados aos produtores com o objetivo de identificar possíveis fatores de risco. Carrapatos foram coletados, identificados e testados por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para o diagnóstico da infecção por Anaplasma marginale, Babesia bigemina e Babaesia bovis. O estudo foi conduzido com 861 bovinos, sendo 468 de Petrolina e 393 de Ouricuri. A soroprevalência de A. marginale, B. bigemina e B. bovis em Petrolina foi de 35,0% (164/468), 35,9% (168/468) e 32,3% (151/468), respectivamente; e em Ouricuri foi de 45,5% (179/393), 38,6% (152/393) e 54,9% (216/393), respectivamente. A co-infecção por Anaplasma spp. e Babesia spp. foi observada em 31,6% e 32,1% de amostras de Petrolina e Ouricuri, respectivamente. A detecção de DNA de Babesia spp. por PCR foi possível em 5,8% (8/137) carrapatos, dos quais em 62,5 % (5/8) foi detectada posteriormente infecção por B. bovis, e em 23,3% (32/137) por A. marginale. A presença de carrapatos, o uso de acaricidas, idade, raça, e o município de residência dos animais foram identificados como fatores de risco para TPB pela análise univariável e multivariável. Este estudo permitiu caracterizar os municípios estudados como de instabilidade enzoótica para esses hemoparasitos, e consequentemente, alertar para adoção de medidas adequadas de controle e realização de novos estudos.

Tristeza Parasitária em bovinos do semiárido pernambucano / Cattle Tick Fever in semi-arid of Pernambuco

Este estudo objetivou determinar a soroprevalência da Babesiose e Anaplasmose em bovinos dos municípios de Ouricuri e Petrolina, estado de Pernambuco, Brasil; e definir os possíveis fatores de risco para a ocorrência dessas doenças. Amostras de sangue foram coletadas para realização de teste sorológico por Imunofluorescência Indireta (RIFI). Questionários epidemiológicos sanitários foram aplicados aos produtores com o objetivo de identificar possíveis fatores de risco. Carrapatos foram coletados, identificados e testados por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para o diagnóstico da infecção por Anaplasma marginale, Babesia bigemina e Babaesia bovis. O estudo foi conduzido com 861 bovinos, sendo 468 de Petrolina e 393 de Ouricuri. A soroprevalência de A. marginale, B. bigemina e B. bovis em Petrolina foi de 35,0% (164/468), 35,9% (168/468) e 32,3% (151/468), respectivamente; e em Ouricuri foi de 45,5% (179/393), 38,6% (152/393) e 54,9% (216/393), respectivamente. A co-infecção por Anaplasma spp. e Babesia spp. foi observada em 31,6% e 32,1% de amostras de Petrolina e Ouricuri, respectivamente. A detecção de DNA de Babesia spp. por PCR foi possível em 5,8% (8/137) carrapatos, dos quais em 62,5 % (5/8) foi detectada posteriormente infecção por B. bovis, e em 23,3% (32/137) por A. marginale. A presença de carrapatos, o uso de acaricidas, idade, raça, e o município de residência dos animais foram identificados como fatores de risco para TPB pela análise univariável e multivariável. Este estudo permitiu caracterizar os municípios estudados como de instabilidade enzoótica para esses hemoparasitos, e consequentemente, alertar para adoção de medidas adequadas de controle e realização de novos estudos.(AU)

This study aimed to determine the seroprevalence of Babesiosis and Anaplasmosis in cattle from the municipalities of Ouricuri and Petrolina, state of Pernambuco, Brazil, and to define the risk factors for the occurrence of the diseases. Blood samples were collected for serologic testing by Indirect Immunofluorescence Assay (IFA). Sanitary epidemiological questionnaires were applied to the producers aiming to identify possible risk factors. Ticks were collected, identified and tested by Polymerase Chain Reaction (PCR) for the diagnosis of infection by Anaplasma marginale, Babesia bigemina and Babesia bovis. The study was conducted with 861 cattle, being 468 in Petrolina and 393 in Ouricuri. The seroprevalence of A. marginale, B. bigemina and B. bovis in Petrolina was of 35.0% (164/468), 35.9% (168/468) and 32.3% (151/468), respectively; and in Ouricuri was 45.5% (179/393), 38.6% (152/393), and 54.9% (216/393), respectively. Co-infection for Anaplasma spp. and Babesia spp. was observed in 31.6% and 32.1% samples of Petrolina and Ouricuri, respectively. The detection of DNA of Babesia spp. by PCR was possible in 5.8% (8/137) ticks; which 62.5% (5/8) was detected later infection with B. bovis; and 23.3% (32/137) with A. marginale. The presence of ticks, the use of acaricide, age, race, and county of residence of the animals were identified as risk factors for TBD by univariate analysis and multivariate. This study allowed the characterization of the municipalities studied as enzootic instability areas for these hemoparasitic, and consequently alert for adoption of adequate control measures and new studies.(AU)

Survey of Ehrlichia canis, Babesia spp. and Hepatozoon spp. in dogs from a semiarid region of Brazil / Pesquisa de Ehrlichia canis, Babesia spp. e Hepatozoon spp. em cães de uma região semiárida do Brasil

This study assessed the occurrence of Ehrlichia spp., Babesia spp. and Hepatozoon spp. infections in 100 tick-harboring dogs from a semiarid region of the State of Paraíba, Northeastern Brazil. Blood samples and ticks were collected from the animals, and a questionnaire was submitted to dog owners to obtain general data. Blood samples were used to perform hemogram, direct blood smear and immunological and molecular hemoparasite detection. The 1,151 ticks collected were identified as Rhipicephalus sanguineus; direct smears revealed E. canis-like morulae in the monocytes of 4% (4/100) of the non-vaccinated female dogs, and 34% and 25% of the dogs tested positive for Ehrlichia canis by indirect immunofluorescence assay (IFA) and polymerase chain reaction (PCR), respectively. Blood smear examination revealed Babesia-suggestive merozoites in the erythrocytes of 2% (2/100) of the animals. Babesia vogeli was detected by PCR in ten animals (10%) and was correlated with young age (p = 0.007) and thrombocytopenia (p = 0.01). None of the animals showed Hepatozoon spp. positivity. These results indicate that E. canis is the main tick-borne canine pathogen in the study area and provide the first report of B. vogeli infection in dogs from Paraiba State.

O presente estudo avaliou a ocorrência de infecção por Ehrlichia spp., Babesia spp. e Hepatozoon spp. em 100 cães, infestados por carrapatos, oriundos de uma região semiárida do Estado da Paraíba, Nordeste do Brasil. Amostras de sangue e de carrapatos foram coletadas dos animais, e um questionário foi submetido aos proprietários dos cães para obter dados gerais. As amostras de sangue foram utilizadas para realização de hemograma, esfregaço sanguíneo e detecção molecular dos hemoparasitos. Os 1.151 carrapatos coletados foram identificados como Rhipicephalus sanguineus; os esfregaços sanguíneos revelaram mórulas sugestivas de E. canis em 4% (4/100) de cães fêmeas não vacinadas, e 34% e 25% dos cães foram positivos para Ehrlichia canis pela imunofluorescência indireta (IFI) e reação em cadeia pela polimerase (PCR), respectivamente. Os esfregaços sanguíneos revelaram merozoítas sugestivas de Babesia em eritrócitos de 2% (2/100) dos animais. Babesia vogeli foi detectada por PCR em dez animais (10%) e foi correlacionada com a idade jovem (p=0,007) e trombocitopenia (p=0,01). Nenhum dos animais apresentou positividade para Hepatozoon spp. Esses resultados indicam que E. canis é o principal patógeno canino transmitido por carrapato, na área estudada, e fornece o primeiro relato de infecção por B. vogeli em cães do Estado da Paraíba.

Molecular and serological detection of tick-borne pathogens in dogs from an area endemic for Leishmania infantum in Mato Grosso do Sul, Brazil / Detecção sorológica e molecular de patógenos transmitidos por carrapatos em cães de uma área endêmica para Leishmania infantum do estado do Mato Grosso do Sul

Tick-borne pathogens affect a wide range of vertebrate hosts. To identify tick-borne pathogens among dogs from Campo Grande, MS, Brazil testing seropositive for Leishmania infantum (syn. L. chagasi), a serological and molecular study was conducted to detect Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Babesia vogeli in 60 serum and spleen samples. A confirmatory diagnosis of L. infantum based on serological and molecular assays was also performed, as was sequence alignment and phylogenetic analysis to assess the identity of the parasite species infecting these animals. IgG antibodies to Ehrlichia spp., B. vogeli and L. infantum were found, respectively, in 39 (65%), 49 (81.6%) and 60 (100%) of the sampled dogs. Twenty-seven (45%), fifty-four (90%), fifty-three (88.3%), two (3.3%) and one (1.6%) dog were positive, respectively, for E. canis, Leishmania spp., Leishmania donovani complex, Babesia sp. and Anaplasma sp. in PCR assays. After sequencing, the amplicons showed 99% of identity with E. canis, B. vogeli, A. platys and Leishmania chagasi isolates. The findings of this study indicate that L. infantum-seropositive dogs from Campo Grande are exposed to multiple tick-borne pathogens, which should therefore be included in the differential diagnosis of dogs with clinical suspicion of leishmaniasis.

Patógenos transmitidos por carrapatos atingem uma variedade de hospedeiros vertebrados. Para identificar os agentes patogênicos transmitidos por carrapatos entre cães soropositivos para Leishmania infantum no município Campo Grande-MS, foi realizado um estudo sorológico e molecular para a detecção de Ehrlichia canis, Anaplasma platys e Babesia vogeli em 60 amostras de soro e baço, respectivamente. Adicionalmente, foi realizado o diagnóstico confirmatório de L. infantum por meio de técnicas sorológicas e moleculares. Também foi realizado o alinhamento e análise filogenética das sequências para indicar a identidade das espécies de parasitas que infectam esses animais. Anticorpos IgG anti-Ehrlichia spp., anti-B. vogeli e anti-L. infantum foram detectados em 39 (65%), 49 (81,6%) e 60 (100%) dos cães amostrados, respectivamente. Vinte e sete (45%), cinquenta e quatro (90%), cinquenta e três (88,3%), dois (3,3%) e um (1,6%) cães mostraram-se positivos na PCR para E. canis, Leishmania spp., Leishmania donovani complex, Babesia sp. e Anaplasma sp., respectivamente. Após o seqüenciamento, os amplicons mostraram 99% de similaridade com isolados de E. canis, B. vogeli e A. platys e Leishmania chagasi. Os resultados deste estudo indicaram que os cães soropositivos para L. infantum de Campo Grande, MS, são expostos a vários agentes transmitidos por carrapatos, e, portanto, devem ser incluídos no diagnóstico diferencial em cães com suspeita clínica de leishmaniose.

Seroprevalence and risk factors for cattle anaplasmosis, babesiosis, and trypanosomiasis in a Brazilian semiarid region / Soroprevalencia e fatores de risco para anaplasmose, babesiose e tripanosomiase bovina em uma região semiárida do Brasil

The seroprevalence of Anaplasma marginale, Babesia bigemina, Babesia bovis and Trypanosoma vivax and the risk factors for these infections were investigated in 509 cows on 37 farms in the semiarid region of Paraíba, northeastern Brazil. Cow serum samples were tested by means of immunofluorescence assay (IFA) against each specific antigen. The mean seroprevalence values per farm were 15.0% (range: 0-75%) for A. marginale, 9.5% (range: 0-40%) for B. bigemina and 26.9% (range: 0-73.7%) for B. bovis. All cows tested negative for T. vivax. Higher prevalence for A. marginale was significantly associated with less frequent acaricide spraying per year and with higher use of injectable antihelminthics. Presence of cows positive for B. bigemina was significantly associated with acaricide use and with presence of horse flies on the farm. Both occurrence and higher prevalence of B. bovis were significantly associated with recent observations of ticks on cattle. Overall, the present results indicate that the region investigated is an enzootically unstable area for A. marginale, B. bigemina and B. bovis, since most animals were seronegative to at least one agent.

A soroprevalência de Anaplasma marginale, Babesia bigemina, Babesia bovis e Trypanosoma vivax, assim como os fatores de risco para estas infecções, foram investigadas em 37 fazendas (total de 509 vacas) da região semiárida da Paraíba, nordeste do Brasil. A presença de anticorpos nos soros dos animais foi detectada pela técnica de imunofluorescência indireta, utilizando antígenos específicos. Os valores médios de soroprevalência por fazenda foram 15,0% (0-75%) para A. marginale, 9,5% (0-40%) para B. bigemina, e 26,9% (0-73,7%) para B. bovis. Todas as vacas foram soronegativas para T. vivax. As maiores prevalências de A. marginale foram significativamente associadas com menor uso de carrapaticidas por ano e com uso mais frequente de antihelmínticos injetáveis. A soroprevalência de B. bigemina foi significativamente associada com o uso de carrapaticidas, e com a presença de mutucas na fazenda. Tanto a ocorrência como a maior soroprevalência para B. bovis nas fazendas foram significativamente associadas com a presença recente de carrapatos nos bovinos. No geral, os resultados indicam que as fazendas amostradas estão situadas em área de instabilidade enzoótica para A. marginale, B. bigemina, e B. bovis, uma vez que a maioria dos animais foi soronegativa para pelo menos um dos agentes.

Serosurvey for tick-borne diseases in dogs from the Eastern Amazon, Brazil / Pesquisa sorológica por doenças transmitidas por carrapatos em cães da Amazônia oriental, Brasil

Canine ehrlichiosis and babesiosis are the most prevalent tick-borne diseases in Brazilian dogs. Few studies have focused attention in surveying tick-borne diseases in the Brazilian Amazon region. A total of 129 blood samples were collected from dogs living in the Brazilian eastern Amazon. Seventy-two samples from dogs from rural areas of 19 municipalities and 57 samples from urban stray dogs from Santarém municipality were collected. Serum samples were submitted to Indirect Immunofluorescence Assay (IFA) with antigens of Babesia canis vogeli, Ehrlichia canis, and six Rickettsia species. The frequency of dogs containing anti-B. canis vogeli, anti-E. canis, and anti-Rickettsia spp. antibodies was 42.6%, 16.2%, and 31.7%, respectively. Anti-B. canis vogeli antibodies were detected in 59.6% of the urban dogs, and in 29.1% of the rural dogs (P < 0.05). For E. canis, seroprevalence was similar among urban (15.7%) and rural (16.6%) dogs. For Rickettsia spp., rural dogs presented significantly higher (P < 0.05) prevalence (40.3%) than urban animals (21.1%). This first study on tick-borne pathogens in dogs from the Brazilian eastern Amazon indicates that dogs are exposed to several agents, such as Babesia organisms, mostly in the urban area; Spotted Fever group Rickettsia organisms, mostly in the rural area; and Ehrlichia organisms, in dogs from both areas studied.

Ehrliquiose canina e babesiose canina são as doenças parasitárias transmitidas por carrapatos de maior prevalência em cães do Brasil. Poucos estudos pesquisaram doenças transmitidas por carrapatos na região da Amazônia brasileira. Um total de 129 amostras de sangue foram colhidas de cães da Amazônia oriental brasileira. Setenta e dois cães eram de áreas rurais de 19 municípios do Estado do Pará, e 57 amostras foram colhidas de cães errantes vadios da área urbana do município de Santarém-PA. As amostras de soro foram submetidas ao ensaio de imunofluorescência indireta, com antígenos de Babesia canis vogeli, Ehrlichia canis, e seis espécies de Rickettsia. A frequência de cães com anticorpos anti-B. canis vogeli, anti-E. canis, e anti-Rickettsia spp. foi de 42,6%, 16,2% e 31,7%, respectivamente. Anticorpos anti-B. canis vogeli foram detectados em 59,6% dos cães urbanos, e em 29,1% dos cães rurais (P < 0.05). Para E. canis, a soroprevalência foi parecida entre os cães urbanos (15,7%) e rurais (16,6%). Para Rickettsia spp., cães rurais apresentaram prevalência (P < 0.05) significativamente maior (40,3%) do que os cães urbanos (21,1%). Esse primeiro estudo sobre agentes transmitidos por carrapatos entre cães da Amazônia oriental brasileira indica que estes animais estão expostos a vários agentes. Estes incluem Babesia principalmente na área urbana, Riquétsias do grupo da Febre Maculosa principalmente nas áreas rurais, e Erliquia em cães de ambas as áreas, rural e urbana.

Detection of antibodies against Babesia bovis and Babesia bigemina in calves from the region of Araguaína, State of Tocantins, Brazil / Detecção de anticorpos anti-Babesia bovis e anti-Babesia bigemina em bezerros na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil

The aim of this study was to determine the seroprevalence of antibodies against B. bovis and B. bigemina in calves from the region of Araguaína, State of Tocantins, Brazil. In this research we used sera obtained from 506 calves, from both genders and of 8 to 24 months old, to detect antibodies by indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA-test). Statistical analysis of the data was performed using the Chi-square (χ2) test with Yates correction. The seroprevalence obtained was 90.5 and 91.7 percent for B. bigemina and B. bovis, respectively, characterizing the region as an area of enzootic stability for the species analyzed. The seroprevalence to B. bovis showed higher positivity among calves 19-24 months old.

O objetivo desse estudo foi determinar a soroprevalência de anticorpos anti-B. bovis e anti-B. bigemina em bezerros da região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil. Nesta pesquisa foram coletadas 506 amostras de soros de bezerros com faixa etária entre 8 e 24 meses, fêmeas e machos, as quais foram processadas pelo ensaio imunoenzimático indireto (ELISA-teste). Como análise estatística utilizou-se o Qui-Quadrado (χ2) com correção de Yates. As prevalências obtidas em bezerros foram de 90,5 e 91,7 por cento para B. bigemina e B. bovis, respectivamente, caracterizando esta região como de estabilidade enzoótica para as espécies analisadas. A soroprevalência para B. bovis apresentou maior positividade entre os bezerros com faixa etária de 19-24 meses.

Prevalence of equine Piroplasmosis and its association with tick infestation in the State of São Paulo, Brazil / Prevalência da Piroplasmose equina e sua associação com infestação por carrapatos no Estado de São Paulo

Serum samples were collected from 582 horses from 40 stud farms in the State of São Paulo and tick (Acari: Ixodidae) infestations were evaluated on them. Serum samples were subjected to the complement fixation test (CFT) and a competitive inhibition ELISA (cELISA) for Babesia caballi and Theileria equi. Logistic regression analyses were performed to construct multivariate models that could explain the dependent variable (horses positive for B. caballi or T. equi) as a function of the independent variables (presence or abundance of each one of the tick species found on the farms). A higher overall prevalence of B. caballi (54.1 percent) than of T. equi (21.6 percent) was found by the two tests. The ticks Dermacentor nitens Neumann, 1897, Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) and Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) were present on horses on 38 (95 percent), 20 (50 percent), and 4 (10 percent) farms, respectively. Infestations by D. nitens were statistically associated with B. caballi-positive horses on the farms by either the CFT or cELISA. Infestations by A. cajennense were statistically associated with T. equi-positive horses on the farms by either CFT or cELISA.

Amostras de soro sanguineo foram coletadas de 582 equinos de 40 haras no estado de São Paulo, onde as infestações por carrapatos foram avaliadas nos animais. Os soros foram testados por reação de fixação do complemento (RFC) e ELISA competitivo por inibição (cELISA) com antígenos de Babesia caballi e Theileria equi. Análises de regressão logística foram realizadas para construir modelos multivariados que pudessem explicar as variáveis dependentes (equinos positivos para B. caballi ou T. equi) em função de variáveis independentes (presença e abundância de cada uma das espécies de carrapatos encontradas nos equinos dos haras). Em geral, os dois testes sorológicos indicaram uma prevalência maior para B. caballi (54,1 por cento) do que para T. equi (21,6 por cento). Os carrapatos Dermacentor nitens Neumann, 1897, Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) e Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) estiveram presentes em equinos de 38 (95 por cento), 20 (50 por cento) e 4 (10 por cento) haras, respectivamente. As infestações por D. nitens estiveram estatisticamente associadas com equinos positivos para B. caballi tanto pela RFC como pelo cELISA. As infestações por A. cajennense estiveram estatisticamente associadas com equinos soropositivos para T. equi, tanto pela RFC como pelo cELISA.

Comparison between a soluble antigen-based ELISA and IFAT in detecting antibodies against Babesia canis in dogs / Comparação entre ELISA feito com antígeno solúvel e imunofluorescência na detecção de anticorpos anti-Babesia canis em cães

An available enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was studied for the detection of anti-B. canis antibodies in the sera of dogs using, indirect fluorescent antibody test (IFAT) as a reference test. ELISA uses a soluble antigenic preparation of B. canis and the optimal dilutions of the antigen, serum and conjugate were determined by check board titration, using positive and negative reference serum. The soluble antigen preparation of B. canis merozoites was 10 µg.mL-1, with reference sera from positive and negative in a single dilution of 1:100, and conjugated to 1:4.000. A total of 246 serum samples were collected from dogs during the rabies vaccination campaign in Jaboticabal, São Paulo, Brazil and examined for the presence of antibodies against B. canis by ELISA and IFAT. Under these conditions, the average absorbance of negative serum was 0.129 ± 0.025, resulting in a cut-off value of 0.323 (ELISA level 3) and the average absorbance of positive reference serum was 2.156 ± 1.187. The serological positive samples tested for B. canis by ELISA and IFAT were 67.89 percent (n = 167) and 59.35 percent (n = 146), respectively. These results suggest that ELISA described may prove to be an effective serological test to diagnose canine babesiosis.

O presente trabalho estudou um ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto para a detecção de anticorpos anti-Babesia canis no soro de cães, tendo a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), como teste de referência O antígeno utilizado no ELISA do presente estudo consistiu em uma preparação antigênica solúvel de merozoítas B. canis e as diluições ótimas do antígeno, soros e conjugado foram determinadas por titulação em bloco, utilizando soros de referência positivos e negativos. A preparação antigênica solúvel de B. canis ótima foi de 10 µg.mL-1, com soros de referência positivos e negativos em uma única diluição de 1:100, e conjugado a 1:4.000. Um total de 246 amostras séricas foram colhidas em cães, durante a campanha de vacinação anti-rábica em Jaboticabal, São Paulo, Brasil e a presença de anticorpos anti-B. canis foi avaliada pelo ELISA e RIFI. Nestas condições, a média de absorbância dos soros de referência negativos foi de 0,129 ± 0,025, resultando em um ponto de corte de 0,323 (Nível de ELISA 3) e a média da absorbância dos soros de referência positivos foi de 2,156 ± 1,187. As amostras com sorologia positiva para B. canis por ELISA e RIFI foram 67,89 por cento (n = 167) e 59,35 por cento (n = 146), respectivamente. Os resultados obtidos sugerem que o ELISA descrito revelou-se um teste sorológico eficaz no diagnóstico da babesiose canina.

Babesia spp. infection in dogs from rural areas of São Paulo State, Brazil / Infecção por Babesia spp. em cães de áreas rurais do estado de São Paulo, Brasil

The status of Babesia spp. infection in dogs from rural areas of São Paulo State, Brazil was studied. For this, 150 animals were examined by blood smears and by PCR; the presence of tick infestation was also investigated. By the blood smear examination, 3 animals (2 percent) were detected positive and by PCR for Babesia spp. 12 (8 percent) were positive, with bands visualized in 450 bp. Rhipicephalus sanguineus or Amblyomma spp. were found on 36 (24 percent) of the 150 dogs. Amblyomma species found were A. cajennense (9/36-25 percent) and A. ovale (9/36-25 percent). It was not possible to correlate the presence of R. sanguineus and the infection with Babesia spp. The sequencing of four positive samples demonstrated close identity with B. canis vogeli already characterized in Brazil.

A presença de infecção por Babesia spp. em cães de áreas rurais do Estado de São Paulo, Brasil foi investigada. Para tanto, 150 cães foram examinados por técnicas parasitológicas de esfregaços sanguíneos e moleculares (PCR), e também, foi verificada a presença de carrapatos nestes animais. Pela análise de esfregaços sanguíneos, 3 (2 por cento) dos cães estavam infectados, enquanto pela PCR, 12 (8 por cento) dos animais foram positivos com bandas aproximadas de 450 pares de base (pb). Foram observados 36 (24 por cento) cães infestados com Rhipicephalus sanguineus ou com Amblyomma spp. As espécies de Amblyomma observadas foram A. cajennense (25 por cento) e A. ovale (25 por cento). Não foi possível correlacionar a presença de R. sanguineus com a infecção por Babesia spp. O seqüenciamento de quatro amostras positivas demonstrou alta identidade com B. canis vogeli, já caracterizada no Brasil.

Estudo comparativo de três métodos de diagnóstico para detecção de anticorpos anti-Theileria equi em eqüinos de áreas endêmicas do estado do Rio de Janeiro / Comparative studies of three methods for detection Theileria equi antibody in endemic areas horses from Rio de Janeiro state

Este trabalho teve o objetivo de avaliar a reação de imunofluorescência indireta (RIFI), ensaio imunoenzimático (ELISA) e a reação de fixação do complemento (RFC) no diagnóstico de Theileria equi em amostras de soro de 79 equinos na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro(UFRRJ), Seropédica, RJ, Brasil. Houve reação positiva para Theileria equi em 74,7, 75,9 e 60,8% das amostras testadas pela RIFI, ELISA eRFC, respectivamente. Observou-se discrepância em 16,45% (n=13) das amostras de soro testadas pelo ELISA indireto e RIFI. Quando comparado a RIFI e a RFC, a discrepância observada entre os soros testados foi de 36,70% (n=29). O teste ELISA indireto e a RFC apresentaram discordância em 37,97% (n=30) das amostras de soros. Os resultados do presente estudo sugerem que a melhor alternativa para o diagnóstico sorológico de T. equi em eqüinos portadores é aassociação dos testes de RIFI e ELISA indireto, especialmente para a realização de estudos soroepidemiológicos

This study was carried out to evaluate indirect fluorescent antibody test (IFAT), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and complement fixation test (CFT) of Theileria equi diagnosis in sera samples of 79 horses at Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro(UFRRJ), Seropédica, RJ, Brazil were tested. Positive reaction was obtained in 74.7, 75.9 and 60.8% of samples tested by IFAT, indirect ELISA and CFT, respectively. Discrepancy was observed in 16.45%(n=13) of serum samples tested by ELISA and IFAT. While IFAT and CFT were compared, the discrepancy observed among the samples tested were 36.71% (n=29). Indirect ELISA and CFT test presented disagreement in 37.97% (n=30) of serum samples tested. Results of present study suggests that the best alternative for serological diagnosis T. equi in carriers horses is the combined use of IFAT and indirect ELISA test, especially for accomplishment of seroepidemiological studies.

Infecção natural por hemoparasitos em bezerros submetidos à quimio-profilaxia aos 30 dias de idade / Natural infection by hemoparasites in calves submitted to chemo -prophylaxis wonder 30 days of age

O complexo Tristeza Parasitária acarreta grandes prejuízos à pecuária bovina nacional. Os principais agentes etiológicos são Babesia bigemina, B. bovis e Anaplasma marginale, sendo o carrapato Boophilus microplus o principal vetor. Este trabalho relata a ocorrência de infecção natural por hemoparasitos da tristeza parasitária bovina em 36 bezerros com alta infestação natural por carrapatos e submetidos à quimioprofilaxia aos 30 dias de idade. Babesia bigemina (33,3 por cento), B. bovis (11,1 por cento) e A. marginale (13,9 por cento) foram detectados em esfregaços sangüíneos de 16 animais (44,4 por cento) de diferentes idades. Seis bezerros apresentaram sintomas (16,7 por cento) e um morreu (2,8 por cento). O número de casos clínicos foi decorrente de uma associação de fatores, destacando-se a alta infestação precoce por carrapatos e a baixa imunidade passiva em período em que os bezerros ainda não haviam desenvolvido imunidade ativa suficiente.

The tick-borne disease (TBD) brings great damages to cattle breeding. The most important etiologic agents are Babesia bigemina, B. bovis and Anaplasma marginale, being the tick Boophilus microplus the main vector. This work reports the occurrence of natural infection by hemoparasites of TBD in 36 calves with high ticks natural infestation submitted to chemoprophylaxis with 30 days year-old. The blood smears from animals of different ages were analized and were found B. bigemina (33.3 percent), B. bovis (11.1 percent) and A. marginale (13.9 percent). Six animals had clinical symptoms (16.7 percent) and one dead (2.8 percent). The number of clinical cases ocurred in consequence of an association of factors as high infestation of ticks and low passive immunity in period that calves had not developed enough active immunity.

Suppressive effect of culture supernatant of erythrocytes and serum from dogs infected with Babesia gibsoni on the morphological maturation of canine reticulocytes in vitro

The present study evaluated the effects of infected culture supernatant of erythrocytes, fractionation of culture supernatant and serum from dogs infected with Babesia gibsoni (B. gibsoni) on the maturation of canine reticulocytes in vitro. The SDS-PAGE demonstrated that significantly broader bands were generated by both the infected culture supernatant of erythrocytes and the serum from dogs chronically infected with B. gibsoni. The culture supernatant of erythrocytes infected with B. gibsoni strongly suppressed the maturation of reticulocytes. Prior studies showed that chronically infected serum had inhibitory effects on both the maturation of reticulocytes and the canine pyrimidine 5'-nucleotidase subclass I and purine-specific 5'-nucleotidase activity. In addition, serum free infected culture supernatant of erythrocytes had an inhibitory effect on the morphological maturation of reticulocytes. These results suggest that infected serum and culture supernatant of erythrocytes might accumulate excess proteins and/or metabolites as a result of the inhibited maturation of reticulocytes and decreased activity of erythrocyte 5'-nucleotidase. Furthermore, the fractions observed at >150 kDa- and 150-70 kDa- in the infected culture supernatant and serum retarded the maturation of canine reticulocytes in vitro. The results obtained from the in vitro examinations, in the present study, suggested that B. gibsoni itself and/or its metabolites might release certain proteins in the infected culture supernatant and serum from infected dogs and as a result delay morphological maturation of canine reticulocytes.

Detection of Babesia bovis in cattle by PCR-ELISA.

We established a new highly sensitive method, PCR-ELISA, for the dectection of Babesia bovis in cattle for farms in Thailand. The detection of around 2.4 x 10(-8)% parasitemia (equivalent to 1 infected erythrocyte per 2 ml) was achieved by PCR amplification followed by the ELISA detection of a biotin tagged gene. When comparing the sensitivity of PCR-ELISA with the microscopic method, our PCR-ELISA method is more sensitive than thin blood smears by at least 1,000 times. The established PCR-ELISA also showed high specificity to B. bovis with no cross reaction to other endemic parasites except for A. marginale. Regarding the detection threshold for B. bovis, the PCR-ELISA method could detect parasites inoculated into splenectomized calves at least 1 week earlier than the thin blood microscopic method. The PCR-ELISA method is a valuable screening technique for B. bovis and applicable for the routine detection of carrier states and automated analysis.

Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for detection of IgM antibodies to Babesia bigemina in cattle

A crude antigenic preparation of Babesia bigemina was used to develop an ELISA for the detection of IgM antibodies. Optimal dilutions of the antigen, using positive and negative reference sera, were determined by checkerboard titrations. Negative sera from cattle imported from tick-free areas, serum samples collected from infected B. bigemina cattle were used to validate the test. The specificity was 94 percent and sensitivity of the Elisa 87.5 percent. Sera from 385 cattle deriving from areas free from tick-borne diseases, which were submitted to a preimmunization process, were screened by this technique. The Elisa detected seroconversion on the 14th day post-inoculation in animals either infested with Boophilus microplus ticks (infected with B. bigemina), or inoculated with B. bigemina infected blood. Antibody titers decreased after day 33; however, all animals remained positive until the end of the experiment (124 days). The ELISA described may prove to be an appropriate serological test for the detection of IgM antibodies against B. bigemina

Prevalência de anticorpos antiBabesia equi em eqüinos no Planalto Catarinense / Prevalence of Babesia equi antibodies in horses in the Santa Catarina Plateau, Brazil

Para avaliar a prevalência de anticorpos antiBabesia equi, através da técnica de imunofluorescência indireta (IFI), foram examinados 397 amostras de soro. As amostras de sangue, para obtençäo dos soros, foram coletadas de eqüinos de diferentes idades, raças, sexos, nascidos e criados no Planalto Catarinense, dos municípios de Lages, Säo Joaquim, Bom Jardim da Serra, Campos Novos, Anita Garibaldi, Curitibanos e Correia Pinto. Os resultados obtidos indicaram a existência de 50,38 por cento de animais sorologicamente reativos para B. equi, na diluiçäo de 1:40. Entre os municípios, os percentuais de animais soropositivos variaram de 18,51 por cento a 64,70 por cento.